Bruken av sanntid RT-PCR i Covid-19

Hva er sanntid RT – PCR?

Å legge fluorescerende gener til PCR-reaksjonssystemet, bruke fluorescenssignalakkumulering for å overvåke hele PCR-prosessen i sanntid, og deretter kvantifisere den ukjente malen gjennom en standardkurve kalles sanntid fluorescens kvantitativ PCR-teknologi, også kjent som sanntid Q -PCR.

Prinsippet for PCR-amplifisering er det samme som for vanlig PCR-instrument, bortsett fra at primerne som ble tilsatt under PCR-amplifisering er merket med isotoper, fluorescein, etc., og primerne og lysstoffrørene brukes til å spesifikt binde seg til malen for amplifisering ved den samme tiden.

De forsterkede resultatene blir samlet og overført til datamaskinanalyse- og prosesseringssystemet gjennom sanntidsinnsamlingssignalet til fluorescenssignalinnsamlingssystemet for å oppnå et kvantitativt sanntidsresultatutgang.

Sanntid RT – PCR er en av de mest brukte laboratoriemetodene for å påvise COVID-19-viruset. Mens mange land har brukt sanntid RT – PCR for å diagnostisere andre sykdommer, for eksempel ebolavirus og Zika-virus, trenger mange støtte for å tilpasse denne metoden for COVID-19-viruset, samt for å øke deres nasjonale testkapasitet.

Hvordan fungerer sanntid RT – PCR med COVID-19-viruset?

En prøve blir samlet fra de delene av kroppen der COVID-19-viruset samles, for eksempel en persons nese eller hals. Prøven behandles med flere kjemiske løsninger som fjerner stoffer som proteiner og fett, og som bare trekker ut RNA som er til stede i prøven. Dette ekstraherte RNA er en blanding av personens eget genetiske materiale og, hvis til stede, virusets RNA.

RNA transkriberes revers til DNA ved bruk av et spesifikt enzym. Forskere legger deretter til ytterligere korte fragmenter av DNA som er komplementære til spesifikke deler av det transkriberte virale DNA. Hvis viruset er til stede i en prøve, knytter disse fragmentene seg til målseksjoner av det virale DNA. Noen av de tilsatte genetiske fragmentene brukes til å bygge DNA-tråder under amplifisering, mens de andre brukes til å bygge DNA og legge markørmerker til strengene, som deretter brukes til å oppdage viruset.

Blandingen blir deretter plassert i en RT – PCR-maskin. Maskinen går gjennom temperaturer som varmer og avkjøler blandingen for å utløse spesifikke kjemiske reaksjoner som skaper nye, identiske kopier av målseksjonene av viralt DNA. Syklusen gjentas om og om igjen for å fortsette å kopiere målseksjonene av viralt DNA. Hver syklus dobler det forrige tallet: to eksemplarer blir fire, fire eksemplarer blir åtte, og så videre. En standard real-time RT – PCR-oppsett går vanligvis gjennom 35 sykluser, noe som betyr at ved slutten av prosessen blir det laget rundt 35 milliarder nye kopier av seksjonene av viralt DNA fra hver virusstreng som er til stede i prøven. .

Når nye kopier av de virale DNA-seksjonene bygges, festes merketikettene til DNA-strengene og slipper deretter et lysstofffarge, som måles av maskinens datamaskin og presenteres i sanntid på skjermen. Datamaskinen sporer mengden fluorescens i prøven etter hver syklus. Når et visst nivå av fluorescens overgås, bekrefter dette at viruset er til stede. Forskere overvåker også hvor mange sykluser det tar å nå dette nivået for å estimere alvorlighetsgraden av infeksjonen: jo færre sykluser, desto mer alvorlig er virusinfeksjonen.

Hvorfor bruke sanntid RT – PCR?

RT-PCR-teknikken i sanntid er svært følsom og spesifikk og kan gi en pålitelig diagnose på så lite som tre timer, selv om laboratoriene i gjennomsnitt tar mellom seks og åtte timer. Sammenlignet med andre tilgjengelige virusisolasjonsmetoder, er RT-PCR i sanntid betydelig raskere og har et lavere potensiale for forurensning eller feil, ettersom hele prosessen kan utføres i et lukket rør. Det fortsetter å være den mest nøyaktige metoden tilgjengelig for påvisning av COVID-19-viruset.

Imidlertid kan ikke RT-PCR i sanntid brukes til å oppdage infeksjoner i fortiden, noe som er viktig for å forstå utviklingen og spredningen av viruset, da virus bare er til stede i kroppen i et bestemt tidsvindu. Andre metoder er nødvendige for å oppdage, spore og studere tidligere infeksjoner, spesielt de som kan ha utviklet seg og spredd seg uten symptomer.